荧光素标记 流式细胞术--偶联抗体荧光素有哪些？如何标记你知道么？

荧光信号是流式细胞仪接收和处理的重要信号。荧光技术的应用使流式细胞术有了质的飞跃，使流式细胞术成为广泛应用于基础生物医学研究和临床诊断的技术。

流式细胞仪接收的荧光信号来自与样品细胞结合的荧光素。荧光素偶联抗体或荧光染料与细胞结合后，细胞将携带相应的荧光素。荧光素被相应的激光激发后，会产生特定波长的荧光。分析荧光信号的强度可以间接反映样品细胞的一些特征。

荧光素

氟化物主要是化学试剂，包括天然的、半天然的和合成的。其他的是蛋白质。当荧光素不被激发时，外层电子处于基态。当被特定波长的激光激发时，外层电子在接收到足够的能量时会跃迁到激发态。处于激发态的外层电子不稳定，会自发地从激发态回到基态，释放出特定波长的荧光。这就是荧光素产生荧光的原理。

不同的荧光素有其特定的激发光和发射光，因此在流动分析中可以同时标记不同波长的荧光素。这些荧光素发出的荧光被不同的荧光通道接收，它们之间的信号采集和分析不会相互干扰，从而使多通道分析成为可能。

随着流式细胞术的发展，多种荧光素被用于流动分析。

普通荧光素

下表总结了流式细胞术中常用的荧光素。

间接标记法包括两个步骤。第一步是用生物素偶联抗体标记样品细胞，第二步是用荧光素偶联链霉亲和素标记样品细胞，如图所示。

间接标记法采用生物素-亲和素系统，是20世纪70年代末发展起来的一种生物反应扩增系统。一个抗生物素蛋白分子可以特异性结合四个生物素分子。生物素和亲和素之间的结合虽然不是抗原抗体结合，但两者结合的特异性、敏感性和结合力并不比抗原和抗体之间弱，在生物学中应用广泛。SA是一种性质与亲和素相似的蛋白质，因其提取自链霉菌而得名。SA的等电点比抗生物素蛋白低，不含糖链，因此其检测的灵敏度和特异性都比抗生物素蛋白高。

当多通道分析需要通道匹配以减少荧光素偶联抗体的类型时，通常使用间接标记。例如进行四色分析时，实验需要分析另一种表面抗原分子，但实验室没有荧光素偶联的抗CTLA-4单克隆抗体，需要购买。根据其他现有抗体和实验要求，可能同时需要FTC偶联的抗CTLA-4单克隆抗体、PE偶联的抗CTLA-4单克隆抗体和Percp偶联的单克隆抗体。这种情况下，如果实验室已经有SA-FITC、SA-PE、SA-Percp、SA-APC，只需购买生物素偶联CTLA-4抗体即可。此时，间接标记法可以满足购买一种抗体的要求，适用于4通道分析，节省了实验成本。

同样，如果实验中需要检测样品细胞中CD25抗原分子的表达，且分配给CD25的荧光通道不确定，则只能购买一种生物素偶联的抗CD25单克隆抗体，间接标记法可以满足实验要求。如果采用直接标记法，需要同时购买FITC偶联抗CD25单克隆抗体、PE偶联抗CD25单克隆抗体、Percp偶联抗CD25单克隆抗体和APC偶联抗CD25单克隆抗体，以满足实验要求。

但当单色分析和多色分析不需要相互匹配通道时，或者当对应荧光素偶联抗体的通道分配非常准确时，应尽量采用直接标记法，因为直接标记法简单，只需要一步标记，结果清晰。直接标记法和间接标记法的比较见表。

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